0 引言

近年来水生态环境问题日益严重, 水中氮素污染状况不断恶化, 氮素超标已成为水体富营养化的一个重要原因.因此去除水中氮素已经成为水污染防治领域的一个热点问题^[1].生物脱氮以无污染、高效率的优点被认为是脱除水中氮素的有效手段^[2].传统的生物脱氮分为硝化过程和反硝化过程^[3-5].自养硝化细菌将水中NH₄⁺-N在好氧条件下氧化为NO₃^--N和NO₂^--N, 反硝化细菌在缺氧的环境下还原NO₃^--N成氮气, 从而脱除水中氮元素.由于反应条件和作用机理不同, 硝化和反硝化过程需分开进行, 导致工艺流程耗时较长.因此科学家希望能够突破传统生物脱氮技术限制, 发掘新型脱氮方法^[6-7]. 1984年, Robertson等人发现了一种能以NO₃^--N和氧气同时作为电子受体的兼养微生物Thiosphaera Pantotropha, 并将此过程命名为好氧反硝化^[8].这一发现突破了传统生物脱氮理论, 此后陆续有学者对好氧反硝化领域展开研究.目前被报道出的好氧反硝化菌属有产碱杆菌属(Alcaligenes)^[9]、假单胞菌属(Pseudomonas)^{[2, 10]}、芽孢杆菌属(Bacillus)^[11]和红球杆菌属(Rhodococcus)^[12]等.综合分析好氧反硝化作用机理的不同观点, 总结起来可以从微环境和生物学角度进行析分^[13-14].前者认为在微生物絮体内, 由于氧传递导致絮体内产生溶解氧浓度梯度, 在外部环境中与空气接触良好的好氧反硝化菌进行硝化作用, 在絮体内部存在厌氧的微环境, 由厌氧菌进行反硝化作用^[15].后者认为好氧反硝化过程中的协同呼吸, 使得氧和NO₃^--N可同时作为电子受体^[8].此外, 在好氧条件下, 膜内硝酸盐还原酶几乎不起作用, 而周质硝酸还原酶能够在高浓度溶解氧条件下表达, 参与完成反硝化过程.较传统的生物脱氮而言, 好氧反硝化菌能够同时进行硝化和反硝化, 缩短工艺流程, 且具有较好的耐高溶解氧性能, 能够利用原水中的碳源完成自身代谢活动, 生长速率快.

本实验从龙泓涧梯级塘底泥中富集出具有异养硝化-好氧反硝化功能的细菌菌群, 讨论了其异养硝化及好氧反硝化生理生化特征, 并研究了不同因素(碳源、碳氮比、pH值和溶解氧)对其脱氮效能的影响, 以期为实际工程应用提供技术借鉴.

1 材料与方法 1.1 样品采集

龙泓涧梯级塘位于杭州西湖西南面, 采用彼得森抓泥斗采集底部沉积物, 随后迅速冷藏运回实验室.

1.2 培养基

富集驯化培养基^[16]: C$_{4}$H$_{4}$Na$_{2}$O$_{4}$ 0.405 1 g/L; KNO$_{3}$ 1 g/L; NH$_{4}$Cl 1 g/L; KH$_{2}$PO$_{4}$ 0.007 g/L; K$_{2}$HPO$_{4}$ 0.027 g/L; MgSO$_{4}$ 0.005 g/L; 微量元素溶液2 mL/L, 调节pH值在7.0$\sim $7.5.

微量元素溶液组成: EDTA 100 mg/L; ZnSO$_{4 }$ 4.4 mg/L; CaCl$_{2}$ 11 mg/L; MnCl$_{2}\cdot $7H$_{2}$O 10.2 mg/L; FeSO$_{4}\cdot $7H$_{2}$O 10 mg/L; (NH$_{4})_6$Mo$_{7}$O$_{24}\cdot $4H$_{2}$O 2.2 mg/L; CuSO$_{4}\cdot $5H$_{2}$O 3.2 mg/L; CoCl$_{2}\cdot $6H$_{2}$O 3.2 mg/L.

初筛固体培养基: C$_{4}$H$_{4}$Na$_{2}$O$_{4}$ 0.405 1 g/L; KNO$_{3}$ 1 g/L; NH$_{4}$Cl 1 g/L; KH$_{2}$PO$_{4}$ 0.007 g/L; K$_{2}$HPO$_{4}$ 0.027 g/L; MgSO$_{4}$ 0.005 g/L; 微量元素溶液2 mL/L, 调节pH值在7.0$\sim $7.5, 琼脂粉20 g.微量元素组成同富集驯化培养基.

复筛固体培养基: C$_{4}$H$_{4}$Na$_{2}$O$_{4}$ 0.405 1 g/L; KNO$_{3}$ 1 g/L; KH$_{2}$PO$_{4}$ 0.007 g/L; K$_{2}$HPO$_{4}$ 0.027 g/L; MgSO$_{4}$ 0.005 g/L; 微量元素溶液2 mL/L, 调节pH值在7.0$\sim $7.5, 琼脂粉20 g.微量元素组成同富集驯化培养基.

DTM液体培养基: C$_{4}$H$_{4}$Na$_{2}$O$_{4}$ 0.405 1 g/L; KNO$_{3}$ 1 g/L; KH$_{2}$PO$_{4}$ 0.007 g/L; K$_{2}$HPO$_{4}$ 0.027 g/L; MgSO$_{4}$ 0.005 g/L; 微量元素溶液2 mL/L, 调节pH值在7.0$\sim $7.5.微量元素组成同富集驯化培养基.

1.3 好氧反硝化菌的筛选

根据郭琳等^[16]和Zhu等^[17]的筛选方法, 取样品10 mL和灭菌水90 mL于250 mL锥形瓶中, 加灭菌玻璃珠震荡混匀, 取以上10 mL混合液加入100 mL灭菌富集驯化培养液, 放入30℃、120 r/min摇床(型号为HPY-91), 每5天更换一次新鲜培养基(10 mL原液+90 mL灭菌培养基). 15 d后取样液10 mL, 加入90 mL灭菌水混匀, 形成混合菌液.采用倍比稀释法稀释成10$^{-1}$到10$^{-7}$梯度的菌悬液, 再用灭菌接种环蘸取菌液在初筛固体培养基上进行划线, 倒置培养皿于30 ℃恒温培养箱(型号为LRH-150F), 每天观察菌落形态.比较挑取生长良好的菌落于复筛固体培养基进行划线分离纯化, 倒置培养皿于30 ℃恒温培养箱, 每天观察菌落形态, 直至得到特征一致的菌落.而后挑取同一平板上长势良好、不同位置的菌落接种于100 mL的DTM培养基中, 放置在30 ℃、120 r/min摇床中, 54 h后测其总氮(TN)去除效率, 选取TN去除率在70%以上的菌进行进一步研究.

1.4 菌群鉴定

DNA提取方法参照AXYGEN公司AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒, 采用细菌普通引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')/806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')对特定区域扩增, 扩增条件参照文献[22].扩增产物采用Illumina技术进行高通量测序, 采用Qiime软件进行数据处理和多样性分析, 由上海美吉生物检测公司完成.

1.5 异养硝化和好氧反硝化性能测定

将筛选出脱氮效率70%以上的菌群LHJ-1接种至装有300 mL灭菌培养基的500 mL锥形瓶中, 放置摇床中, 每6小时取样监测TN、NO₃^--N、NO₂^--N、NH₄⁺-N、总有机碳(TOC)、OD$_{600}$指标, 通过比较54 h内菌群生长, 碳源和氮源利用情况, 分析LHJ-1在不同条件下的硝化和反硝化性能.

1.6 不同环境因子影响实验

实验选取碳氮比(C/N)、碳源、初始pH值和溶解氧(DO) 4个因素探究环境因子对菌群生长的影响. C/N为4、8、12、16和20;碳源为乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠和葡萄糖; 初始pH值为3、5、7、9和11;本实验通过改变摇床转速实现不同的溶解氧梯度, 设置转速60、90、120和150 r/min.以DTM液体培养基为基础, 根据不同因素的不同水平设置单一变量, 考察菌群30 ℃下第30小时的TN、NO₃^--N、NO₂^--N、NH₄⁺-N和OD$_{600}$的变化, 对不同碳源的利用情况.

1.7 实验指标分析方法

菌群生长状况OD$_{600}$采用UV-7504单光束紫外-可见分光光度计(下同)测定; TN浓度采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定(GB11894-89); NH₄⁺-N浓度采用纳氏试剂分光光度法测定; NO₃^--N浓度采用紫外分光光度法测定; NO₂^--N浓度采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定(GB7493-87); TOC浓度采用总有机碳分析仪(型号为TOC-L CPN CN200)测量.

2 结果与讨论 2.1 菌群鉴定

细菌生物多样性检测是基于对16S rDNA功能基因等特定区域片段PCR产物进行高通量测序, 来探究物种的群落组成和进化关系.高通量测序结果表明(如图 1所示), LHJ-1为混合菌群, 在属水平上主要由Pseudomonas(74.34%)、Cupriavidus(2.79%)、Acidovorax(10.44%)、Acinetobacter(11.09%)和Pseudoduganella(1.16%)构成, 其中假单胞菌属(Pseudomonas)占比最大, 成为优势菌.假单胞菌属是典型的好氧反硝化菌^[18], 这表明经过长时间的富集和驯化, 菌群LHJ-1已成为由好氧反硝化菌主导的功能群落.

不同菌属的细菌混合生长, 物种多样性丰富, 提高了系统的稳定性, 菌种之间的协同共生作用, 在实际应用中具有更好的环境适应性, 更有利于水中氮素和有机物的脱除.

2.2 菌群LHJ-1的异养硝化特性

异养菌较自养菌而言, 可利用环境中的有机碳源维持自身生长, 生长速率快, 细胞产量高^[19], 同时达到降解有机物的目的.本文为了考察LHJ-1的异养硝化性能, 将其接种至以NH$_{4}$Cl为唯一氮源、丁二酸钠为碳源的培养基中, 结果如图 2所示.

0$\sim $6 h内细菌处于适应期, 生长较为缓慢. 6$\sim $18 h细菌处于对数增长阶段, 细菌量迅速增加, OD$_{600}$值从0.008增长至0.112.与此同时, 碳源浓度也迅速下降, 从113.175 mg/L下降至30.353 mg/L, 平均降解速率为4.601 mg/(L$\cdot $h), 降解率为73.18%.由此可见, 细菌利用了大量外部碳源来供自身生长, 具有明显的异养功能. NH₄⁺-N浓度在0$\sim $6 h内迅速下降, 从最初3.081 mg/L降至0.003 mg/L, 去除率达99.90%, 而后趋于稳定.细菌生长与NH₄⁺-N的去除存在一个滞后过程, 可能是由于菌体先吸收氮源和碳源后需要一个利用转化过程, 此现象与康鹏亮研究^[20]一致. TN的去除主要集中在细菌的对数生长阶段, 从0 h到18 h, TN去除率达83.04%, 最大去除率在第30小时, 达到93.58%.随后细菌生长进入衰亡期, TOC和TN浓度都有所回升, 最后趋于稳定.这可能是由于碳源消耗殆尽, 当碳源不足时, 不足以提供充足的能量供菌生长, 细菌通过自溶获取能量, 造成细胞内有机碳和有机氮的释放.苏兵等人研究发现以NH$_{4}$Cl为氮源时认为菌体自溶会导致NH₄⁺-N浓度上升^[21], 而本实验中NH₄⁺-N浓度在第6小时后一直保持较低水平, 至衰亡期才有些许升高而后又迅速降低.安强等人粗提了菌株NR的氨单加氧酶(AMO)和羟胺氧化酶(HAO), 从酶学角度证明了菌株NR的硝化性能^[22].检测报告表明, 菌群LHJ-1中存在AMO和HAO, 推测由于HAO具有良好的酶活性, LHJ-1具有良好的硝化性能. NO₂^--N浓度一直较低, 整个过程中基本无NO₂^--N积累, 此现象与黄廷林等人的研究结果^[23]一致. NO₃^--N在体系中呈现出先缓慢上升后下降的趋势.最高积累量达1.181 mg/L, 第36小时后开始下降, 稳定在0.500 mg/L左右.由此也能看出菌群LHJ-1可以在好氧条件下进行反硝化, 具有好氧反硝化功能.田凤蓉等人在研究菌株LH-N7的NH₄⁺-N去除时有类似发现^[24], 体系中NO₃^--N不断积累, 随着反应时间延长积累量下降.硝化过程中产生的酸度, 随着好氧反硝化作用的发生, 产生的碱度补偿部分酸度^[25], 酸对反硝化作用抑制减弱, 可能是导致NO₃^--N浓度先升高再降低的原因.另外, 王国英等人认为原因可能是由于在反应初期, NH₄⁺-N充足, 异养硝化作用强于好氧反硝化作用, 后期NH₄⁺-N浓度降低, 好氧反硝化作用强于异养硝化作用^[26].

2.3 菌群LHJ-1的好氧反硝化特性

本次实验分别以KNO$_{3}$和NaNO$_{2}$为唯一氮源, 以丁二酸钠为碳源, C/N为16, 接种对数生长期(OD$_{600}$值为0.091)菌液2 mL, 探究菌群LHJ-1的好氧反硝化特性.

在以NO₃^--N为唯一氮源的情况下, 观察54 h内细菌脱氮特性, 如图 3(a)所示.可知, 细菌的生长于TOC的降解趋势和TN的去除具有一致性, 与异养硝化过程情况相同. 6 h到18 h细菌处于对数生长期, TOC由113.100 mg/L降解至49.080 mg/L, 降解率为56.60%.第30小时时, TOC降解效率达到最大, 为67.12%. TN浓度在18 h内迅速下降到1.408 mg/L, 平均去除速率为0.275 mg/(L$\cdot $h), TN去除率达到76.73%. TOC和TN浓度在细菌内源呼吸期都有所上升, 与异养硝化阶段类似. NO₃^--N在0$\sim $6 h去除最快, 去除率达81.57%, 平均去除速率0.817 mg/(L$\cdot $h). TOC和NO₃^--N的减少说明菌群LHJ-1具有较好的好氧反硝化能力^[27]. 30℃时, LHJ-1最大NO₃^--N去除效率达92.46%, 高于已报道的菌株Ochrobactrum sp. tbtd^[28]的最大NO₃^--N去除效率(76.96%), 说明LHJ-1菌群较Ochrobactrum sp. tbtd菌株具有更强的反硝化性能.在NO₃^--N快速去除的同时, NO₂^--N出现少量积累, 最高积累量出现在第6小时为0.890 mg/L, 随即又下降, 保持在0.200 mg/L左右的水平.康鹏亮等人认为反硝化初期NO₂^--N的短暂积累可能是由于反硝化初期NO₃^--N去除率较高造成NO₂^--N的大量积累, 随着NO₃^--N去除达到平衡, NO₂^--N的去除效率提高^[20].这与本实验现象一致.

图 3(b)所示是以NaNO$_{2}$为唯一氮源, 54 h内LHJ-1表现出的好氧反硝化性能.由图可知, 细菌依然是在18 h内处于对数生长期, 这与异养硝化特性、以NO₃^--N为氮源时表现一致.氮源和碳源作为细菌生长的重要营养物质, 变化情况与细菌生长呈现同步趋势.反硝化作用初始, NO₂^--N以0.829 mg/(L$\cdot $h)的速率下降, 对应去除率达77.16%, 此时细菌并没有立即迅速繁殖, 这也与异养特性一致.细菌对NO₂^--N的最大利用率达89.67%, 对TN的最大去除率达72.11%, 实验末期, NO₂^--N和TN的浓度有所回升, 分别维持在1.900 mg/L和2.500 mg/L.实验期间, NO₃^--N有明显累积量, 6 h最大累积量达2.690 mg/L, 36 h累积量达1.182 mg/L.出现此现象的原因可能是由于NO₂^--N初始浓度过高, 高浓度的NO₂^--N抑制了硝酸盐还原酶的活性, 导致NO₃^--N去除效果差.随着NO₂^--N浓度逐渐下降, 抑制作用减弱, 积累的NO₃^--N量逐渐减少.整个过程中无NH₄⁺-N积累.

综上所述, 菌群LHJ-1能够利用NO₃^--N和NO₂^--N为氮源进行好氧反硝化, 这与P. stutzeri YZN-001^[10]和P. tolaassi Y-11^[25]表现相同. LHJ-1对NO₃^--N最大利用率92.46%大于对NO₂^--N的利用率89.67%, 最大TN去除率分别为79.07%和72.11%.

2.4 不同环境因子对菌群LHJ-1的脱氮影响 2.4.1 不同C/N对菌群LHJ-1的脱氮影响

碳和氮作为细菌生长过程的基本营养物质, 其配比不同直接影响着异养硝化好氧反硝化细菌的脱氮效率. C/N过高, 会导致资源能源浪费且降低反硝化速率; C/N过低, 能源不足, 也会抑制菌的生长^[19].因此, 寻找合适C/N是提高好氧反硝化菌脱氮能力且节约资源的重要环节.如图 4所示, 当C/N从4上升至20时, TN和NO₃^--N去除率同步先升高后降低, C/N为4时TN和NO₃^--N去除率均达最低值, 分别为28.30%和24.11%, NH₄⁺-N和NO₂^--N积累达最高值, 均超出1.000 mg/L; 当C/N达到16时去除率达最高值, 分别为75.95%和78.30%. OD$_{600}$在5个C/N梯度下基本一致, 说明不同C/N对菌体生长状态影响不明显, 但过低C/N会造成碳源成为限制因素, 导致提供的电子流少而慢, 从而降低了反硝化速率, 影响了氮素的去除.从实验可知, LHJ-1适宜的C/N为16.对于特定菌株, 应根据其新陈代谢特征和面临的环境因素选择合适的C/N^[29].

2.4.2 碳源种类对菌群LHJ-1的脱氮影响

不同碳源具有不同的氧化还原电位^[23], 是细菌好氧反硝化过程中的电子供体和能源物质, 影响着硝酸盐还原酶的活性^[27], 进而会影响细菌的脱氮效果.如图 5所示.菌群对4种碳源的利用率从高到低排序依次为乙酸钠(57.32%)、丁二酸钠(56.43%)、柠檬酸钠(46.16%)和葡萄糖(34.94%). 4种碳源下OD$_{600}$均显著增多, 由高到低排序为葡萄糖(0.122)、柠檬酸钠(0.111)、丁二酸钠(0.087)和乙酸钠(0.078).从图上可知, 菌体生长情况与TN去除具有一致性, 菌体密度越大, 对TN的去除率就越大.葡萄糖组TN和NO₃^--N去除率均最高, 分别为93.92%和92.73%, 柠檬酸钠组、丁二酸钠组和乙酸钠组的TN去除率分别为81.96%、68.85%和59.24%, 与之对应的NO₃^--N去除率为83.76%、74.66%和77.04%.以上数据表明, 不同碳源会导致菌群对NO₃^--N的去除能力产生差异, 这可能与它们的氧化还原电位有关^[30].

颜薇芝等人认为不动杆菌属YN3更易利用有机酸, 当碳源是葡萄糖时, 菌体基本不增长^[31].本实验中相较于有机酸, 当碳源为葡萄糖时, 菌群生长最好, 这与YN3表现不同.蔡茜等人筛选出的蒙氏假单胞菌H97在以上4种碳源中生长, 对葡萄糖和TN去除率均最低, TN去除率仅为46.42%; LHJ-1与H97相反, 其对葡萄糖利用率最低, 对TN去除率却最大^[32].本实验中, NH₄⁺-N积累量很少, 均小于0.050 mg/L, NO₂^--N积累量也较少, 乙酸钠组的NO₂^--N积累量最大达0.227 mg/L, 丁二酸钠、柠檬酸钠和葡萄糖组均少于0.060 mg/L.以上说明菌群LHJ-1能够利用上述碳源生长, 具有好氧反硝化能力.

2.4.3 不同pH值对菌群LHJ-1的脱氮影响

微生物生长过程中pH值是重要的影响因素之一. pH值过高或过低会降低微生物的酶活性, 改变微生物细胞膜电位, 从而影响微生物的代谢活动和营养吸收.过低的pH值会导致核酸和微生物表面蛋白的水解变质, 抑制微生物的生长代谢^[31].如图 6所示, 溶液为强酸性(pH=3)和强碱性(pH=11)时, OD$_{600}$值仅为0.001和0.002, 细菌生长几乎被完全抑制.同时TN和NO₃^--N去除率极低, NH₄⁺-N和NO₂^--N积累量极少, 脱氮作用受到严重限制.说明细菌LHJ-1在强酸或强碱环境中不宜生存, 反硝化活性极低.当pH值为5、7、9时, 细菌生长活跃, OD$_{600}$高于0.080, 反硝化活性较高, TN去除率均高于75%, 分别为79.61%、75.95%和78.56%, NO₃^--N去除率有所升高, 分别为86.03%、78.32%和96.91%.在pH值为9时虽然能够获得更好的NO₃^--N去除率, 但是NH₄⁺-N积累量大达1.399 mg/L.已报道的研究表明, 大部分的好氧反硝化菌都能在中性或偏碱性条件生长^[25], 本研究中菌群LHJ-1在偏酸、中性和偏碱条件下均有较强的脱氮能力, 预示其应用范围更为广泛.

2.4.4 不同DO浓度对菌群LHJ-1的脱氮影响

摇床转速与DO浓度之间存在正相关的线性关系, DO浓度也是影响微生物好氧反硝化代谢的重要因素之一, 决定了NO₂^--N的去除效率^[33].由图 7可看出, 当转速提升, NO₃^--N去除率基本相同, 均在70%以上, 90 r/min时稍低为74.78%.菌体密度OD$_{600}$和TN去除具有一致性. 60、90和120 r/min时OD$_{600}$较高, 分别为0.088、0.097和0.083, 对应TN去除率为76.40%、78.34%和75.95%. 150 r/min时OD$_{600}$较小, 仅为0.022, TN去除率也较少为51.41%, 而NO₃^--N去除率却为77.55%.造成此现象的原因可能是细菌能够利用NO₃^--N进行自身生长, 但由于转速高, 导致细菌与摇瓶碰撞, 细胞破裂, 内部氮转移至溶液中, 因此导致了TN去除率下降, OD$_{600}$也较小.在60 r/min时NH₄⁺-N积累量最大为0.749 mg/L, 硝化作用发生缓慢. 90 r/min和150 r/min时NO₂^--N积累量明显较高, 分别为0.942 mg/L和1.678 mg/L.已报道的研究表明, 低溶解氧水平抑制了NO₂^--N向NO₃^--N的转化^[34], 较高的溶解氧水平又会抑制亚硝酸盐还原酶活性^[35], 这与本研究结果相吻合, 因此合适的溶解氧水平是微生物提高反硝化速率同时减少NO₂^--N积累的关键因素之一.

3 结论

从龙泓涧梯级塘底泥中筛选出具有异养硝化-好氧反硝化功能的菌群LHJ-1, 主要包含Pseudomonas、Cupriavidus、Acidovorax、Acinetobacter和Pseudoduganella, 其中Pseudomonas占比最大.异养硝化特性探究结果表明, 菌群LHJ-1对NH₄⁺-N和TN的最大去除率分别为99.90%和93.58%, 具有较强的异养硝化功能.好氧反硝化性能研究中, 菌群LHJ-1对NO₃^--N和NO₂^--N的最大去除率分别为92.46%和89.67%, 具有明显的好氧反硝化性能.研究还进一步证实, 多种环境因子对菌群LHJ-1的脱氮效率影响显著.环境因子影响实验表明, 菌群LHJ-1发挥异养硝化-好氧反硝化功能的最佳C/N为16, 最佳碳源为葡萄糖, 最佳pH值范围为5$\sim $9, 最佳通氧转速为60$\sim $120 r/min, 在对应的培养条件下, 菌群LHJ-1达到了较高的脱氮效率.

该菌拟用于处理生活污水的厌氧/好氧(A/O)工艺中.生活污水中COD通常在300$\sim $400 mg/L, 较高的在500 mg/L左右, NH₄⁺-N浓度在30 mg/L左右.由上述结果可知, 当C/N为16时TN去除效果最高, 而实际应用中原水很难达到较高的C/N, 这可能导致碳源不足, 从而降低处理效果.因此在后续的实验中需加强对LHJ-1的驯化, 使其能够适应较低的C/N条件, 并取得较好的脱氮效果.