近年来, 国家已逐步加大对农村地区生活污水厂建设的投入^[1].然而, 现有农村生活污水厂普遍存在技术和资金短缺、监管不到位及运行维护不善的问题, 致使多数污水厂不能正常运转, 农村生活污水的水质未经有效净化便直接排放, 特别是氨氮(NH$_{4}^{+}$-N)及总氮(TN)的过量排放问题尤为突出^[2].农村生活污水中氮素的超量排放是造成农村地区水环境恶化和水生态退化的主要原因之一^[3-4].因此, 亟需对现有非正常运转的农村生活污水厂进行强化脱氮改造, 以使其出水的NH$_{4}^{+}$-N及TN达到一级B标准(GB 18918-2002)的要求(NH$_{4}^{+}$-N$ \le $8 mg/L, TN$ \le $20 mg/L).

垂直流人工湿地作为一种新兴的污水生态处理技术, 在水力负荷率、污染物净化性能、运维管理等方面具备明显优势^[5-6], 现已广泛应用于农村地区的生活污水净化及地表水体修复领域.然而, 采用垂直流人工湿地作为现有非正常运转的农村生活污水厂的后续工艺进行强化脱氮的研究还鲜见报道.另外, 国内外对垂直流人工湿地的试验研究多集中在单一填料的净化特性, 而将不同填料进行组合的湿地的净化性能研究得尚不透彻.例如:陶粒和沸石, 这两种填料不仅廉价易得, 而且陶粒能够通过其表面的多孔结构促进生物膜的生长与微生物的代谢活性, 沸石则因其良好的氨氮吸附性能常被用于污水中氨氮的去除^[7-8].然而, 将陶粒和沸石作为垂直流人工湿地组合填料的试验研究较少, 且对于组合填料的净化机制尚不十分明确.

因此, 本研究选取垂直流人工湿地用于农村生活污水的强化脱氮试验, 并选取陶粒和沸石作为其组合填料, 通过研究该湿地系统对农村生活污水的脱氮性能, 并结合湿地植物对TN去除的贡献率及微生物群落结构多样性解析该湿地系统的脱氮机理, 以期为该湿地系统服务于农村生活污水强化脱氮的工程化应用提供理论依据.

试验设置了2组平行的垂直流人工湿地中试装置:湿地1(W1)和湿地2(W2)(如图 1(a)和(b)所示).本试验于2015年4月底在室外开展.两个湿地系统的表面积均为0.70 m$^{2}(L\times D$=1.00 m$\times $0.70 m), 净容积均为0.49 m$^{3}(L\times W\times H$=1.00 m$\times $0.70 m$\times $0.70 m), 均选取菖蒲作为其栽培植物(W1和W2各种植了20株), 并采用穿孔配水管于填料上表面均匀布水(如图 1(c)所示), 且湿地水位低于填料上表面2$\sim $5 cm. W1和W2的出水重力自流至各自的出水池($L\times W\times H$=0.70 m$\times $0.30 m$\times $0.70 m), 出水池的水体通过蠕动泵匀速泵出. W1只填充70 cm陶粒, W2上层填充45 cm陶粒、下层填充25 cm沸石.上述陶粒和沸石均购置于江苏省昆山市. W1和W2的填料种类、配比及规格详见表 1.

图 1(Fig. 1)

图 1 W1和W2构造示意图和实物图 Fig.1 Schematic diagram and photo of structure for W1 and W2

表 1(Tab. 1

表 1 垂直流湿地的填料类型、配比及规格 Tab.1 Filler type, proportion and specification for the vertical flow wetlands 湿地编号 填料材质 填充高度/m 质量/kg 粒径/mm 孔隙率/% W1 生物陶粒 0.7 235 20$\sim $30 75 W2 生物陶粒 0.45 150 20$\sim $30 75 天然斜发沸石 0.25 45 5$\sim $10 50

表 1 垂直流湿地的填料类型、配比及规格 Tab.1 Filler type, proportion and specification for the vertical flow wetlands

W1和W2的进、出水流量($Q)$均为0.21 m$^{3}$/d, 水力负荷率(HLR)=0.30 m$^{3}$/(m$^{2}\cdot $d), 水力停留时间(HRT)=56 h. W1和W2的进水水质采用南岛试验基地的非正常运转的厌氧/好氧(A/O)系统出水(用于模拟非正常运转的农村生活污水厂出水, 该出水水质劣于我国城镇污水厂的一级B排放标准), 其主要水质指标为NH$_{4}^{+}$-N 23.9$\sim $36.9 mg/L, 硝酸盐氮(NO$_{3}^{-}$-N) 2.8$\sim $6.8 mg/L, TN 35.7$\sim $47.8 mg/L, 化学需氧量(COD$_{\rm Cr})$ 84.9 $\sim $99.6 mg/L.本试验于该系统稳定运行1个月后启动.

自2015年5月至2016年9月, 每隔两周对W1和W2的出水池进行水样采集(采样深度约为水面下20 cm).水样的COD$_{\rm Cr}$、TN、NH$_{4}^{+}$-N、NO$_{3}^{-}$-N和NO$_{2}^{-}$-N的测定于24 h内在实验室完成.采样期间避开降雨(雨停24 h后), 以避免雨水对该湿地系统进、出水水质的影响.上述指标的测定方法参照《水和废水监测分析方法》(第四版).无特别说明外, 所用试剂均为分析纯, 实验用水为新鲜去离子水.

在本试验过程中, 定期记录植物高度, 并对生长初期、生长旺盛期以及衰亡期的植物样本做分析.此外, 在试验的始末阶段, 分别对W1和W2栽培的植物进行采集.样本采集利用"S"形采样法选取5株植株作为一个样本, 共计2个样本.测定上述样本的氮含量, 并依照相关文献所述方法计算植株吸收对污水中TN去除的贡献率^[9].

湿地单元共计5个生物膜样本, 其中湿地1菖蒲根系样本记为W1R, 湿地2菖蒲根系样本记为W2R, 湿地1中陶粒顶面以下10 cm深度的陶粒生物膜样本记为W1U, 湿地2中陶粒顶面以下10 cm深度的陶粒生物膜样本记为W2U, 湿地2中沸石顶面以下10 cm深度的沸石生物膜样本记为W2D.根系表面采样方法:用剪刀剪掉根部(小心根系表面附着物), 放入自封袋, 立即带回实验室冷藏; 快速用事先准备好的锥形瓶装好适量无菌水与样品, 振荡, 待根系表面附着物振荡脱落入锥形瓶后, 倒入离心管离心, 取离心管下部固体物, 冷冻; 填料采样方法:湿地填料用小铁铲采取, 其余步骤和上述根系表面采样方法相同.以上采样器材在使用前均经过无菌处理, 同时联系生工生物工程(上海)股份有限公司尽快取样.

生工生物工程(上海)股份有限公司采用Power Soil DNA分离试剂盒提取5个样品中的DNA.采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的细菌总DNA.对16S rRNA基因的V3-V4高变区片段进行PCR扩增, 引物序列为515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和909R(CCCCGYCAATTCMTTTRAGT).随后在该公司的Illumina MiSeq平台上进行高通量测序分析, 得到原始图像数据文件经CASAVA碱基识别分析转化为原始测序序列, 结果以FASTQ文件格式储存.利用Mothur对原始序列进行校正, 去除序列中的嵌合体, 得到优化序列; 在97%的相似性水平上将序列划分可操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs); 采用RDP Classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类分析, 并在门和属水平上统计每个样品的群落组成^[10].

数据统计分析采用Excel 2016软件, 图表绘制采用Origin 9.1软件, 并用SPSS 20.0软件对各项指标进行Pearson相关性分析及ANOVA方差分析.

为评价2种垂直流人工湿地系统的实际运行效果, 本文将试验运行按照季节分为5个阶段, 分别是: 2015年夏、2015年秋、2015年冬、2016年春及2016年夏.图 2(a)展示了湿地系统各阶段的NH$_{4}^{+}$-N平均浓度及其去除率. NH$_{4}^{+}$-N的进水浓度波动较大, 且冬季和春季的进水NH$_{4}^{+}$-N浓度明显高于夏季和秋季.在试验过程中, W1出水的NH$_{4}^{+}$-N浓度均未达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)规定的一级B标准, 而W2出水的NH$_{4}^{+}$-N在2015年夏、秋季可满足一级A标准, 在2015年冬季仍可满足一级B标准.

图 2(Fig. 2)

图 2 W1和W2对NH$_{4}^{+}$-N (a)、NO$_{3}^{-}$-N (b)和TN (c)的去除性能及菖蒲不同生长阶段的茎、叶的含N量(d) Fig.2 For wetlands W1 and W2, the NH$_{4}^{+}$-N (a), NO$_{3}^{-}$-N (b), and TN (c) removal performance and N content in the stems and leaves and the roots of calamus in different growing stages (d)

试验结果还显示: W2对NH$_{4}^{+}$-N的去除率始终高于W1, 且W1和W2对NH$_{4}^{+}$-N的去除率具有显著差异性($p <$0.05).这表明添加沸石填料的试验组能够明显提高垂直流人工湿地对NH$_{4}^{+}$-N的去除效果.然而W1和W2在试验的最后阶段对NH$_{4}^{+}$-N的去除率均有明显下降(W1降低至25%, W2降低至58%), 可能的原因是湿地填料发生了堵塞.垂直流人工湿地填料层的堵塞会造成其渗透系数急剧下降, 严重影响填料的吸附效果^[11].综合而言, 采用"陶粒+沸石"组合填料的垂直流人工湿地对污水中NH$_{4}^{+}$-N的平均去除率高于采用"陶粒"单一填料的垂直流人工湿地的23%, 其原因主要是沸石填料的加入强化了湿地系统对污水中NH$_{4}^{+}$-N的吸附作用.

图 2(b)展示了W1和W2在各试验阶段的NO$_{3}^{-}$-N进出水平均浓度变化趋势.进水的浓度仅为进水NH$_{4}^{+}$-N浓度的0.1$\sim $0.3倍, 说明进水中NO$_{3}^{-}$-N的含量较低.但由第2.1节的分析结果可知, W1和W2中均存在强烈的硝化作用, 这为水体中氮素的反硝化提供了反应基质(NO$_{3}^{-}$-N).试验各阶段W1和W2出水的NO$_{3}^{-}$-N浓度没有显著性差异($p <$0.05), 表明"陶粒+沸石"的填料组合相比单一陶粒填料对垂直流人工湿地系统的NO$_{3}^{-}$-N去除并无明显影响.

湿地系统对NO$_{3}^{-}$-N的去除主要依靠反硝化菌群的反硝化作用^[12].由试验结果可知, W1出水的NO$_{3}^{-}$-N浓度大于W2;由于出水的NO$_{3}^{-}$-N主要是由进水本身含有的NO$_{3}^{-}$-N和硝化菌硝化作用生成的NO$_{3}^{-}$-N组成, 这说明W1的硝化能力大于W2, 而W2的反硝化能力强于W1. Zhao等研究发现, C/N在2.5$\sim $5.0时人工湿地对污水中氮素的去除效果最好^[13].本试验湿地系统的进水COD$_{\rm Cr}$浓度偏低(大多阶段C/N低于2.5).污水厂进水中往往由于缺少碳源而限制湿地对硝酸盐氮的反硝化作用^[14].在C/N条件极为不利的条件下, W2的反硝化能力仍然较高, 这一方面可能是由于植物根系分泌物和植物根系的腐烂物为异养反硝化菌提供了碳源, 另一方面可能是由于下层沸石较小的孔隙率减弱了水体复氧效应, 从而使下层水体更易在缺氧环境下发生反硝化.

图 2(c)展示了W1和W2在5个季度中的TN平均浓度及去除率变化趋势. TN进水的平均浓度与NH$_{4}^{+}$-N进水平均浓度呈正相关($r $=0.963$^{\ast \ast }$, $p$=0.008), 主要原因是湿地系统进水中的氮素以NH$_{4}^{+}$-N为主要赋存形态.试验结果显示, W1出水的TN仅在前两个阶段(2015年夏、秋季)达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)规定的一级B标准, 而W2出水TN在2015年夏、秋季可满足一级A标准, 在2015年冬季及2016年春季可满足一级B标准.

湿地对污水TN的去除途径主要包括填料吸附、植物吸收及微生物作用^[17].在试验各阶段中, W2对TN的去除效果始终优于W1($p <$0.05), 这一方面是由于W2填充的沸石促进了对污水中NH$_{4}^{+}$-N的大量吸附^[18], 另一方面可能是由于W2分层填充的结构更利于硝化-反硝化和厌氧氨氧化等微生物的生长^[19].综合来看, 采用"陶粒+沸石"组合填料的垂直流人工湿地对污水中TN的平均去除率高于采用"陶粒"单一填料的垂直流人工湿地的25%, 其原因主要是W2中沸石填料对污水中的NH$_{4}^{+}$-N具有较好的吸附效果.

另外, W1和W2进出水的NO$_{2}^{-}$-N浓度在试验全程中均较低($ <$0.1 mg/L).亚硝酸盐积累意味着微生物对污水中氮素的硝化及反硝化作用不完全^[20].由此可见, 本研究垂直流湿地系统中微生物对NH$_{4}^{+}$-N及NO$_{3}^{-}$-N的转化作用进行地较为完全.

本研究的湿地系统在第一年脱氮效率较高, 但次年便有明显下降, 其原因可能是长期运行后湿地填料出现了吸附饱和或堵塞现象, 以及植物残体腐败导致了二次污染.由此可见, 为了确保湿地系统的长期稳定运行, 应每年对湿地填料进行一次翻新, 并对湿地植物进行一次收割.相比农村生活污水厂的维护, 上述湿地维护方案较为简便, 因此具有在农村地区推广的可行性.

菖蒲因其根系发达, 泌氧能力好, 再生能力强, 具有较强的耐寒、耐污及吸收污染物的性能, 所以非常适合作为湿地的栽培植物^[21].图 2(d)展示了W1和W2的菖蒲不同生长阶段的茎、叶含N量变化趋势. 2015年试验开始时菖蒲幼苗的茎叶和根的N含量分别为20.96 g/kg和26.45 g/kg. 2015年冬季收割时菖蒲已经枯黄, W1茎叶和根的N含量分别为13.55 g/kg和14.26 g/kg, W2茎叶和根的N含量分别为10.76 g/kg和13.33 g/kg. 2016年间, 经过越冬期之后, 菖蒲重新萌芽生长, 其植株体内N含量逐渐升高. 2016年夏季菖蒲生长旺盛时, W2和W1的茎叶的干重分别为0.19 kg/m$^{2}$和0.18 kg/m$^{2}$, N的积累量分别为4.08 g/m$^{2}$和3.80 g/m$^{2}$.

通过分析可知, 即使W2中菖蒲的氮素积累量相对高于W1, 但是其吸收对污水中TN去除的贡献率却低于W1, 这间接说明W2中N的去除更多的依赖于填料吸附和微生物作用.通过计算, 两种垂直流人工湿地对污水中TN去除的贡献率均低于0.5%, 因此填料吸附和微生物净化是该湿地系统脱氮的主要途径, 而该系统的植物栽培应更多地考虑其导水导流作用、根系微生物富集作用及生态效益和景观价值.

为探究垂直流人工湿地降解污染物的微生物作用机制, 本研究通过对W1和W2中5个植物根系及填料生物膜样本进行高通量测序, 共得到395 930条优质序列, 平均长度为419.75 bp.以97%相似度划分, 共得到31 266个OTUs.各样品文库的覆盖率(Coverage)范围为94%$\sim $95%, 说明样品中基因序列被检出的概率很高, 本次测序结果能够代表湿地填料和植物根系表面细菌群落的真实情况.表 2为5个样品中的优质序列、OTU数量及多样性指数. Chao1指数用来反应物种丰度, 可以用来估计OTUs数目; Shannon指数用来反应物种的多样性, Shannon指数越高, 表示其微生物群落的多样性越高.

表 2(Tab. 2

表 2 W1和W2中5个样本的优质序列、OTUs、Chao1、Coverage和Shannon指数 Tab.2 Parameters of qualified sequence of OTUs, Chao1, Coverage and Shannon indices of five samples from W1 and W2 样品 序列 相似水平(Similarity) OTUs Chao1指数 覆盖率/% Shannon指数 W1R 72 890 5 648 21 657 94 5.05 W2R 70 831 5 440 16 570 95 5.81 W1U 86 383 6 749 27 048 94 6.15 W2U 82 530 6 515 22 729 94 6.36 W2D 83 296 6 914 23 267 94 6.03

表 2 W1和W2中5个样本的优质序列、OTUs、Chao1、Coverage和Shannon指数 Tab.2 Parameters of qualified sequence of OTUs, Chao1, Coverage and Shannon indices of five samples from W1 and W2

W1R和W2R的微生物丰度和多样性相对低于W1U和W2U, 这可能是由于根际环境相对单调而使微生物的种类相对集中^[22].填料结构的差异引起了湿地系统中微生物种群丰度和多样性差异, W2R的微生物丰度和多样性相对高于W1R; W2U的微生物丰度和多样性相对高于W1U, W2U的微生物丰度和多样性相对高于W2D, 这可能是由于湿地下部厌氧环境分布集中而有利于厌氧功能微生物的集中分布^[23].有研究表明, 微生物多样性对维持生态系统的稳定性和抗扰性有很大作用, 微生物多样性越丰富其维稳和抗扰能力越强^[24].因此, 采用"陶粒+沸石"组合填料的垂直流人工湿地比采用"陶粒"为单一填料的垂直流人工湿地更有利于湿地植物根系和填料上微生物的群落结构稳定性.

为了揭示填料及植物根系样品中微生物的菌群结构, 将97%相似水平的OTU代表序列在属水平上进行分类统计.通过图 3可知W1和W2的5个样本列出了50个属类, 包括不动杆菌属(Acinetobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、黄杆菌属(Cloacibacterium)、乳球菌属(Lactococcus)、产吲哚金黄杆菌(Chryseobacterium)等.其中, 不动杆菌属(Acinetobacter)是5个样品中的优势菌种.已有研究表明, 不动杆菌属(Acinetobacter)可进行"好氧反硝化"作用^[25].由图 3可知, 不动杆菌属(Acinetobacter)在W1R中的占比明显高于W2R, 表明W1的植物根系中含有比例更高的"好氧反硝化"相关菌种.这可能是因为W1的陶粒层较厚且陶粒孔隙率较大, 更有利于植物根系生长.不动杆菌属(Acinetobacter)在W1U和W2U中的占比在5个微生物样品中最低, 而在W1D中的占比则较高, 这表明该菌属更容易在沸石表面生长.因此, 沸石填料的加入有利于垂直流人工湿地中"好氧反硝化"相关菌种的富集.

图 3(Fig. 3)

图 3 W1和W2中5个样本在属面上的群落组成 Fig.3 Bacterial community composition at the genus level of five samples from W1 and W2

在W1和W2填料及植物根系中具有硝化功能的菌属主要包括亚硝化菌属(Nitrobacter)和硝化螺菌属(Nitrosospira)和亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)等^[26]. W1R、W1U、W2R、W2U和W2D中具有硝化功能的相关菌属占比分别为1%、2%、1%、2%和1%, 因此具有硝化功能的菌属主要集中在两种垂直流人工湿地的陶粒表面. W1和W2填料及植物根系中具有反硝化功能的菌属主要包括不动杆菌属(Acinetobacter)、陶厄氏菌属(Thauera)及红环菌科的两个菌属(Dechloromonas和Denitratisoma)^[27]. W1R、W1U、W2R、W2U和W2D中具有反硝化功能的相关菌属占比分别为42%、22%、10%、8%和18%, 因此具有反硝化功能的相关菌属主要集中在两种垂直流人工湿地的植物根系上, 且沸石表面的反硝化菌属占比明显高于陶粒, 这可能与沸石的表面结构及所处水位的环境条件有关, 具体机理仍需进一步探讨.综上, 组合填料式垂直流人工湿地的植物根系及填料生物膜中含有丰富的硝化及反硝化相关菌属, 这为该湿地系统应用于农村生活污水的强化脱氮提供了有力保障.

(1) 相比采用"陶粒"单一填料的垂直流人工湿地, 采用"陶粒+沸石"组合填料能够将垂直流人工湿地对农村生活污水中NH$_{4}^{+}$-N及TN的去除率分别提升23%和25%, 且其出水的NH$_{4}^{+}$-N及TN浓度均能达到一级B标准(GB 18918-2002).

(2) 两种垂直流人工湿地中的植物吸收对污水中TN去除的贡献率均低于0.5%, 因此填料吸附和微生物净化是该湿地系统脱氮的主要途径, 而该系统的植物栽培应更多地考虑其导水导流作用、根系微生物富集作用及生态效益和景观价值.

(3) 相比采用"陶粒"单一填料的垂直流人工湿地, 采用"陶粒+沸石"组合填料能够促进湿地系统中植物根系及填料上的微生物群落多样性, 因而更有利于微生物群落结构的稳定性.

(4) 组合填料式人工湿地的植物根系及填料中具备丰富的硝化和反硝化功能菌群, 从而为该湿地系统应用于农村生活污水的强化脱氮提供了有力保障.