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  华东师范大学学报(自然科学版)  2019 Issue (3): 138-143, 154  DOI: 10.3969/j.issn.1000-5641.2019.03.015
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引用本文  

孙莉玮, 高雪笛, 许丹尔, 等. 超低温保存下藓类植物孢子萌发率的变化：以6种藓类植物为例[J]. 华东师范大学学报(自然科学版), 2019, (3): 138-143, 154. DOI: 10.3969/j.issn.1000-5641.2019.03.015.
SUN Li-wei, GAO Xue-di, XU Dan-er, et al. Variation in germination rates of moss spores using a cryopreservation technique: A case study of spores from six moss species[J]. Journal of East China Normal University (Natural Science), 2019, (3): 138-143, 154. DOI: 10.3969/j.issn.1000-5641.2019.03.015.

基金项目

国家自然科学基金（31770371）；华东师范大学本科生创业训练培育项目（2017PY-424）；上海市大学生创新活动项目（201510269105）

第一作者

孙莉玮, 女, 硕士研究生, 研究方向为苔藓植物分子地理及种质资源保存研究.E-mail:51161300063@stu.ecnu.edu.cn

通信作者

王健, 男, 副研究员, 主要从事苔藓植物分类及种质资源保存研究.E-mail:jwang@bio.ecnu.edu.cn

文章历史

收稿日期：2018-05-25
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
超低温保存下藓类植物孢子萌发率的变化：以6种藓类植物为例
孙莉玮 , 高雪笛 , 许丹尔 , 王书琴 , 杨卓筠 , 王健     
华东师范大学 生命科学学院, 上海 200241
收稿日期：2018-05-25
基金项目：国家自然科学基金（31770371）；华东师范大学本科生创业训练培育项目（2017PY-424）；上海市大学生创新活动项目（201510269105）
第一作者：孙莉玮, 女, 硕士研究生, 研究方向为苔藓植物分子地理及种质资源保存研究.E-mail:51161300063@stu.ecnu.edu.cn
通信作者：王健, 男, 副研究员, 主要从事苔藓植物分类及种质资源保存研究.E-mail:jwang@bio.ecnu.edu.cn
摘要：为了检验苔藓植物孢子超低温保存方法的适用性，该文对采自不同生境中的6种藓类孢子超低温保存前的干燥时间和低温预处理进行探索，并在最适处理条件下对其中5种藓类孢子进行不同时间梯度（1 d、15d、30 d、90 d和180 d）的超低温保存研究.结果表明：①经过干燥和低温预处理后，6种藓类孢子的最高萌发率均维持在较高水平（87.25%~96.21%）；②与低温预处理相比，干燥处理在孢子超低温保存中更为关键.孢子在只进行干燥处理情况下其最高平均萌发率为74.97%~96.21%，而只对其进行低温预处理时的最高平均萌发率变化较大，从21.73%到90.94%；③5种藓类孢子在液氮保存1d后的平均萌发率均最高（87.25%~96.21%），且随着保存时间的延长，所有藓类孢子的萌发率都有所下降，但仍维持在相对较高的水平（73.69%~86.60%）；④葫芦藓、丝瓜藓和长蒴藓孢子在保存30d后萌发率分别为86.49%、86.60%和84.98%，卵蒴真藓和丛生真藓孢子在保存180d后萌发率仍可达到73.69%和84.17%.研究表明，藓类孢子非常适合于超低温保存，而且可能代表一种简单、稳定、高效的苔藓植物种质资源保存材料.
关键词：苔藓植物    藓类    生境    孢子    超低温保存    
Variation in germination rates of moss spores using a cryopreservation technique: A case study of spores from six moss species
SUN Li-wei , GAO Xue-di , XU Dan-er , Wang Shu-qin , YANG Zhuo-jun , WANG Jian     
School of Life Sciences, East China Normal University, Shanghai 200241, China
Abstract: To evaluate the applicability of cryopreservation for bryophyte spores, this study explored the effect of dehydration time and low temperature pretreatment; the study was used to identify the optimal conditions for six moss spores collected from different habitats. In addition, varying time periods (1 d, 15 d, 30 d, 90 d, 180 d) of spore cryopreservation were studied under the optimal pretreatment conditions identified. The results showed that:①After dehydration and low temperature pretreatment, the highest germination rates of spores from the six moss species were maintained (87.25%~96.21%). ②Compared to low temperature pretreatment, dehydration seems to be the key point of success for spore cryopreservation. The average spore germination rates ranged from 74.97% to 96.21% when treated with dehydration alone; in comparison, germination rates ranged from 21.73% to 90.94% when pretreated with low temperature alone. ③The average germination rates of spores from five moss species maintained their respective highest level (87.25%~96.21%) after cryopreservation for 1 d and then decreased with the prolongation of storage time; nevertheless, the germination rates still remained at relatively high levels (73.69%~86.60%).④ The average germination rates of spores from Funaria hygrometrica, Pohlia elongate, and Trematodon longicollis after storage for 30 d were 86.49%, 86.60%, and 84.98%, respectively. The germination rates of spores from Bryum blindii and B. caespiticium reached 73.69% and 84.17%, respectively, after storage for 180 d. The study indicates that the procedure for spore cryopreservation could be a simple, stable, and efficient method for storage of bryophyte species in conservation programs.
Keywords: bryophyte    moss    habitats    spores    cryopreservation    
0 引言

苔藓植物是高等植物中最原始的一个类群, 联系着维管植物和它们的藻类祖先, 在陆生植物进化研究中发挥着关键作用; 作为自然界的拓荒者之一, 苔藓植物在防止水土流失及维持生态系统平衡方面发挥着重要的作用; 同时, 作为高等植物中物种数量仅次于被子植物的一个类群, 也是生物多样性的重要组成部分[1].但是, 由于其独特的形态、生境和生活史特点, 苔藓植物特别容易受到周围环境变化及人类活动干扰的影响.鉴于苔藓植物巨大的生态应用价值及在生物多样性中的重要地位, 其多样性保护日渐受到重视[2].对于苔藓植物来说, 其野外就地保护大多是偶然的, 主要是在保护其他物种的同时顺带实现了对其保护[1].然而, 尽管已经建立较完备的保护区网络, 位于欧洲的马卡罗尼西亚地区35种特有苔藓植物中有6种将在50年后灭绝, 即使是当地分布最广泛的种类也会达到易危甚至濒危的程度[3].因此, 开展对苔藓植物, 尤其是特有濒危种类的迁地保护尤为重要.

目前, 超低温保存技术已经在植物种质资源保存研究方面被广泛应用.国际上, 苔藓植物种质资源超低温保存研究主要集中在对其配子体及原丝体保存研究方面, 缺乏对孢子体的保存研究[4-7].这主要有两方面原因, 一是因为苔藓植物中雌雄异株比例较高, 有70%的苔类和60%的藓类为雌雄异株, 这些类群常常因为雌、雄株之间的距离较大而导致卵细胞很难受精, 从而导致孢子体材料很难获得[1];二是因为苔藓植物的孢子体非常微小, 在野外很容易被忽视.因而, 同样作为孢子植物, 有很多关于蕨类植物孢子的超低温保存的研究, 有关苔藓植物的孢子保存研究的报道却很少[8-9].然而, 苔藓植物配子体及原丝体的超低温保存效果与其植物体在自然环境中对干燥和低温的忍耐能力紧密相关, 需要在保存前进行干燥及低温预处理.而且, 一些生长在湿润环境中的种类极易受干燥处理的影响, 超低温保存后的成活率非常低, 比如采自湿润生境中的2种泥炭藓(Sphagnum girgensohnii和S. russowii), 其配子体在超低温保存后的再生率仅为20%[6, 10].相反, 不同生境中的苔藓植物孢子似乎受干燥处理影响不大[11].因此, 苔藓植物孢子的超低温保存有可能解决湿润生境种类的种质资源超低温保存问题, 而且很有可能代表一种简单、稳定又便捷的苔藓植物超低温保存手段.

我们在2014年初步探索并确定了苔藓植物孢子超低温保存方法, 并将其成功应用于细叶小羽藓(Haplocladium microphyllum)的超低温保存[12].但是, 该方法只在一个种中得到检验, 其适用性还是未知的.为了检验超低温保存方法的适用性, 本文对采自不同生境中的6种藓类孢子进行超低温保存研究, 并对其中5种藓类的孢子进行不同时间梯度的超低温保存效果研究.

1 材料与方法 1.1 实验材料

6种藓类孢子体于2013$\sim$2014年间分别采于广西、贵州、上海、四川、云南和西藏(见表 1).新鲜标本连同基质置于培养皿中, 外包保鲜袋后带回实验室置于人工智能气候培养箱(温度15 ℃, 光照周期12 h明暗交替)培养, 直到孢子体完全成熟.凭证标本存于华东师范大学生物博物馆(HSNU).

表 1 实验材料 Tab. 1 Materials used in experiment
1.2 孢子超低温保存最适条件的筛选

参照李秋萍等方法[12], 在体式显微镜下选择色泽相近、体型饱满的成熟孢蒴, 分别置于硅胶中0 h (CK)、5 h、10 h和20 h后取出, 投入1.5 mL的冻存管中, 然后分别于15$\sim$18 ℃ (CK)、4 ℃和$-$20 ℃下低温预处理1 d后迅速投入液氮.液氮保存1 d后取出, 在22$\sim$25 ℃下自来水化冻, 然后接种至Knop固体培养基中培养, 光强为3 000$\sim$3 200 lx, 温度25 ℃/18 ℃, 湿度保持在(80$\pm $5)%.接种8 d后于显微镜下检测孢子的萌发率, 以原生质体突出一极, 叶绿体进入突起中形成萌发管定为孢子已萌发, 并以未经液氮保存的新鲜孢子的萌发率作为对照.

1.3 孢子超低温保存不同时间的效果比较

参照李秋萍等方法[12], 在各种藓类孢子最适的处理条件下, 选取成熟的孢蒴通过设置时间梯度(1 d、15 d、30 d、90 d和180 d)进行不同时间的保存实验.每个处理条件保存7—8个成熟的孢蒴, 保存不同时间后取出, 采用室温下自来水冲洗化冻, 然后接种至Knop固体培养基上培养.接种8 d后于显微镜下检测孢子的平均萌发率.在统计萌发率的时候, 每个处理条件接种3个培养皿, 每个培养皿选取3个视野于显微镜下观察, 统计孢子平均萌发率.由于所需孢蒴数量较多, 有部分藓类因为孢蒴采集数量不能满足时间梯度实验, 故日本曲尾藓未进行不同时间梯度保存实验, 长蒴藓、葫芦藓和丝瓜藓的时间梯度只设置到30 d.

1.4 数据分析

使用Excel 2010进行数据处理, 采用SPSS19.0程序对实验结果进行统计分析, 均值的多重比较采用邓肯氏(Duncan)新复极差检验和LSD法检验[13], 检验水平$\alpha $=0.05, 进行显著性比较.

2 研究结果 2.1 不同干燥时间和低温预处理对6种藓类孢子超低温保存后萌发率的影响

图 1显示, 干燥和低温预处理都影响到孢子的萌发率, 6种藓类孢子萌发率在最适处理条件下均大于87%.长蒴藓(T. longicollis)孢子在15$\sim$18 ℃下干燥20 h萌发率为96.21%, 葫芦藓(F. hygrometrica)孢子在4 ℃下干燥10 h萌发率为94.31%, 丛生真藓($B.$ caespiticium)孢子在15$\sim$18 ℃下干燥5 h萌发率为92.01%, 卵蒴真藓(B. blindii)孢子在15$\sim$18 ℃下干燥10 h萌发率为87.25%, 丝瓜藓(P. elongata)孢子在4 ℃下干燥20 h萌发率为90.86%, 日本曲尾藓(D. japonicum)孢子在4 ℃下干燥5 h萌发率为91.22%.相对于低温预处理, 干燥处理在孢子超低温保存中更为关键.在对孢子只进行干燥处理情况下, 6种藓类孢子的最高平均萌发率水平为74.97%$\sim$96.21%, 而在对孢子只进行低温预处理时, 孢子的最高平均萌发率变化较大, 从21.73%到90.94%.

注: (a)长蒴藓; (b)葫芦藓; (c)卵蒴真藓; (d)丛生真藓; (e)丝瓜藓; (f)日本曲尾藓.萌发率用平均值和标准差表示, 字母不同表示差异显著($\alpha $=0.05) 图 1 不同干燥时间和低温预处理条件下6种藓类孢子超低温保存后萌发率比较 Fig.1 A comparison of germination rates for spores from six moss species after cryopreservation with varying dehydration times and low temperature pretreatments

不同生境中的种类所需的干燥和低温预处理条件稍有不同, 对于采自干旱生境中的长蒴藓和丛生真藓, 只需要对其孢子进行不同时间长度的硅胶干燥处理就可达到最高萌发率(分别为96.21%和92.01%).但是, 对于采自湿润生境中的日本曲尾藓和丝瓜藓, 孢子需要分别在4 ℃下干燥5 h和20 h才能达到最高萌发率(分别为91.22%和90.86%).对于常见种葫芦藓, 不同处理条件下的孢子萌发率均表现出较高水平(81.43%$\sim$94.31%).

2.2 5种藓类孢子超低温保存不同时间后的平均萌发率

在最适处理条件下, 5种藓类孢子在超低温保存1 d后均表现出最高的萌发率(87.25%$\sim$96.21%), 在液氮中保存30$\sim$180 d后仍维持较高的萌发率(73.69%$\sim$86.60%)(见表 2).随着保存时间的延长, 除了长蒴藓孢子萌发率表现出逐渐的下降趋势外, 其他4种藓类的孢子萌发率都表现出不稳定的先降后升的趋势.葫芦藓和丝瓜藓的孢子在超低温保存15 d后萌发率均有一定程度的下降(77.03%和76.97%), 至30 d时孢子平均萌发率又分别上升到86.49%和86.60%.而卵蒴真藓和丛生真藓孢子的平均萌发率随着保存时间的延长, 表现出先降后升再降又升的趋势, 至180 d时孢子平均萌发率维持在73.69%和84.17%.

表 2 5种藓类孢子超低温保存不同时间后萌发率比较 Tab. 2 Comparison of germination rates for spores from five moss species under different
3 讨论

由于苔藓植物配子体的结构简单以及消毒困难, 其超低温保存时需要使用无菌培养的材料, 这一过程需要耗费较长时间, 而且配子体在超低温保存过程中必须借助特定的冰冻保护剂才能避免在冷冻过程中受到伤害.即使这样, 配子体的超低温保存成功还与物种固有的对干燥和低温的耐受力有关[6, 10].而苔藓植物孢子的抗旱性能已被证明与其生境并无太大关系[11], 这可能与孢子表面具有孢粉素等化合物而赋予其较强的抗物理损伤和逆境性能有关[1].除此之外, 苔藓植物的孢子在水势低至--2 MPa时仍可以萌发, 而大多数种子在这种水势下则失去萌发能力[14].这些特点都表明了苔藓植物孢子非常适合于超低温保存, 而且可能代表一种简单、稳定、高效的苔藓植物种质资源保存材料, 这一结论在本研究中得到了证明.

相对于低温预处理, 本研究表明超低温保存前的干燥处理有助于孢子的保存.实验数据显示经过干燥处理的6种藓类孢子萌发率普遍大于未经干燥的孢子.超低温保存的成功与否所遇到的最大挑战是保存材料是否具备在极端低温下忍耐冷却和复苏的能力, 而在这个冷冻过程中的由水向冰过渡所引发的生物物理变化被认为是造成机体伤害的主要原因[15].因此, 孢子含水量的控制是其保存成功与否的关键[12].为了避免这种伤害, 有必要对超低温保存前的植物材料进行脱水处理[6].因为本文重点在于检测一种保存方法在保存不同生境中孢子的适用性, 故未对孢子的含水量进行定量测定.但是, 对于采自湿润生境中的藓类孢子比如日本曲尾藓和丝瓜藓, 干燥加低温预处理则为最佳的处理条件, 这可能表明相对较湿润的孢子在超低温保存前更需要进行低温诱导.

与李秋萍等[12]实验结果相似, 本文在对5种藓类孢子进行不同时间梯度保存效果研究时发现:孢子的平均萌发率在保存后第一天均为最高, 但随着保存时间的延长其萌发率出现先降后升又降的趋势, 而且不同保存时间内孢子萌发率表现出显著性的差异.从理论上来讲, 孢子在液氮保存情况下其物质代谢和生长活动几乎完全停止[16], 其萌发率在短期内应该不会表现出类似的显著性差异.这一异常现象在蕨类的孢子、种子植物的花粉[17], 甚至是苔藓植物芽胞中也存在[18], 推测其原因可能与保存材料在超低温保存过程中先受到伤害而又启动修复功能的过程有关[12].在接下来的研究中, 可以利用透射电镜观察不同保存时间的孢子细胞内部结构是否受到破坏, 来探讨发生这一现象可能的原因.

参考文献
[1]
VANDERPOORTEN A, GOFFINET B. Introduction to Bryophyte[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 2010: 1-2.
[2]
HYLANDER K, JONSSON B G. The conservation ecology of cryptogams[J]. Biological Conservation, 2007, 135(3): 311-314. DOI:10.1016/j.biocon.2006.10.019
[3]
PATIÑO J, MATEO R G, ZANATTA F, et al. Climate threat on the Macaronesian endemic bryophyte flora[J/OL]. Scientific Reports, 2016. Doi: 10.1038/srep29156. https://www.nature.com/articles/srep29156.pdf
[4]
PENCE V C. Cryopreservation of bryophytes:The effects of abscisic acid and encapsulation dehydration[J]. Bryologist, 1998, 101(2): 278-281. DOI:10.1639/0007-2745(1998)101[278:COBTEO]2.0.CO;2
[5]
BURCH J, WILKINSON T. Cryopreservation of protonemata of Ditrichum cornubicum (Paton) comparing the effectiveness of four cryoprotectant pretreatments[J]. CryoLetters, 2002, 23(3): 197-208.
[6]
BURCH J. Some mosses survive cryopreservation without prior treatment[J]. Bryologist, 2003, 106(2): 270-277. DOI:10.1639/0007-2745(2003)106[0270:SMSCWP]2.0.CO;2
[7]
ROWNTREE J K, RAMSAY M M. How bryophytes came out of the cold:Successful cryopreservation of threatened species[J]. Biodiversity and Conservation, 2009, 18: 1413-1420. DOI:10.1007/s10531-008-9453-x
[8]
PANGUA E, GARCIA-ALVAREZ L, PAJARÓN S. Studies on Cryptogamma crispa spore germination[J]. American Fern Journal, 1999, 89(2): 159-170. DOI:10.2307/1547350
[9]
ROGGE G D, VIANA A M, RANDI A M. Cryopreservation of spores of Dicksonia sellowiana:An endangered tree fern indigenous to south and central America[J]. CryoLetters, 2000, 21: 223-230.
[10]
SEGRETO R, HASSEL K, BARDAL R, et al. Desiccation tolerance and natural cold acclimation allow cryopreservation of bryophytes without pretreatment or use of cryoprotectants[J]. Bryologist, 2010, 113(4): 760-769. DOI:10.1639/0007-2745-113.4.760
[11]
VAN ZANTEN B O, GRADSTEIN S R. Experimental dispersal geography of neotropical liverworts[J]. Beiheft zur Nova Hedwigia, 1988, 90: 41-94.
[12]
李秋萍, 姜丽佳, 鲁蓓蓓, 等. 细叶小羽藓孢子的超低温保存[J]. 华东师范大学学报(自然科学版), 2014(6): 121-125. DOI:10.3969/j.issn.1000-5641.2014.06.016
[13]
杜荣骞. 生物统计学[M]. 北京: 高等教育出版社, 2003.
[14]
WIKLUND K, RYDIN H. Ecophysiological constraints on spore establishment in bryophytes[J]. Functional Ecology, 2004, 18(6): 907-913. DOI:10.1111/fec.2004.18.issue-6
[15]
FULLER B J. Cryoprotectants:the essential antifreezes to protect life in the frozen state[J]. CryoLetters, 2004, 25(6): 375-388.
[16]
简令成. 低温生物学与植物种质的长期保存[J]. 植物学通报, 1998, 5(2): 65-68.
[17]
徐艳, 刘燕, 石雷. 大叶黑桫椤孢子超低温保存[J]. 植物生理学通讯, 2006, 42(1): 55-57.
[18]
WU S P, QIN Z Z, XIAO T Z, et al. Cryopreservation of gemmae of Marchantia polymorpha L. (Marchantiophyta, Marchantiaceae) without prior pretreatment[J]. CryoLetters, 2015, 36(2): 91-96.